1. Ruang Lingkup
Standar ini digunakan untuk menentukan bakteri indicator sanitasi (Coliform dan E.coli) pada produk perikanan.
2. Istilah dan Definisi
Coliform
bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik.
Faecal Coliform
kelompok bakteri fakultatif aerob, gram negatif tidak membentuk spora, berbentuk batang
pendek, mampu memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas serta tumbuh pada suhu 45oC + 0,5oC selama sekurang-kurangnya 24 jam.
E. coli
bakteri gram negatif yang berbentuk batang pendek atau coccus, tidak membentuk spora.
3. Peralatan
a) waterbath bertutup dengan sirkulasi 45oC + 0,5oC;
b) inkubator 35oC ± 1oC;
c) blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher;
d) botol pengencer;
e) tabung durham;
f) cawan petri ukuran 15 mm x 90 mm;
g) tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100 mm;
h) timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;
i) mikroskop;
j) pipet atau pippetor 1ml, 5 ml dan 10 ml.
5 Media dan pereaksi
a) Brilliant Green Lactose Bile (BGLB), 2 % Broth
b) Lauryl Tryptose Broth (LTB)
c) EC Broth
d) Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB ) agar
e) Tryptone (Tryptophane) Broth (TB)
f) MR-VP Broth
g) Simmon Citrate Agar
h) Plate Count Agar
i) Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered (BFP)
j) Pereaksi Kovacs
k) Pereaksi VP
l) Indikator MR
m) Pereaksi pewarnaan gram
6. Persiapan Contoh
Timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji , kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan BFP. Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10-1.
7. Tahap analisa
Uji pendugaan coliform (Presumptive coliform)
a) Siapkan pengenceran 10-2 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer BFP. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.
b) Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri tabung lauryl tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham.
c) Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC ± 1oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
d) Lakukan “Uji penegasan coliform” untuk tabung-tabung positif.
Tabung-tabung LTB sebelum diinkubasi
Tabung-tabung LTB positif
Uji penegasan coliform (confirmed coliform)
a) Inokulasikan tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC ±1oC.
b) Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC ±1oC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
c) Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung BGLB yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g coliform”
Tabung-tabung BGLB Positif
Uji pendugaan Escherichia coli (faecal coliform, presumptive Escherichia coli)
a) Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi EC Broth dalam waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45oC ± 0,5oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.
b) Periksa tabung-tabung EC Broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
c) Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g faecal coliform”.
Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli)
a) Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke LEMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC + 1oC.
b) Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.
c) Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escherichia coli dari masing-masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC+ 1oC.
d) Jika koloni yang khas (typical ) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring.
Media Selektif LEMB Agar (Positif)
Uji morfologi
Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli
terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek.
8. Uji biokimia
Produksi indol ( I )
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone Broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.
Uji voges proskauer (VP)
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH, kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby).
Uji methyl red (MR)
Inkubasikan kembali MRVP Broth di atas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Tambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.
Uji sitrat (C)
Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.
Produksi gas dari laktosa
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring kedalam LTB. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35oC +1oC V.VC reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham.
9. Interpretasi Hasil
Tabel 1. Interpretasi hasil
| Kriteria | Biotipe 1 | Biotipe 2 |
| Gas pada tabung LTB | + | + |
| Indol | + | - |
| MR | + | + |
| VP | - | - |
| Citrat | - | - |
| Uji Morfologi | Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora | Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora |
10. Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil di atas, nyatakan coliform dan Escherichia coli dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM).
Tabel 2. Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif dari 3 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2 dan 10 3
| Tabung positif | APM/g | Tingkat kepercayaan | Tabung positif | APM/g | Tingkat kepercayaan | ||||||
| 101 | 102 | 103 | Bawah | Atas | 101 | 102 | 103 | Bawah | Atas | ||
| 0 | 0 | 0 | <3,0 | - | 9,5 | 2 | 2 | 0 | 21 | 4,5 | 42 |
| 0 | 0 | 1 | 3,0 | 0,15 | 9,6 | 2 | 2 | 1 | 28 | 8,7 | 94 |
| 0 | 1 | 0 | 3,0 | 0,15 | 11 | 2 | 2 | 2 | 35 | 8,7 | 94 |
| 0 | 1 | 1 | 6,1 | 1,2 | 18 | 2 | 3 | 0 | 29 | 8,7 | 94 |
| 0 | 2 | 0 | 6,2 | 1,2 | 18 | 2 | 3 | 1 | 36 | 8,7 | 94 |
| 0 | 3 | 0 | 9,4 | 3,6 | 38 | 3 | 0 | 0 | 23 | 4,6 | 94 |
| 1 | 0 | 0 | 3,6 | 0,17 | 18 | 3 | 0 | 1 | 38 | 8,7 | 110 |
| 1 | 0 | 1 | 7,2 | 1,3 | 18 | 3 | 0 | 2 | 64 | 17 | 180 |
| 1 | 0 | 2 | 11 | 3,6 | 38 | 3 | 1 | 0 | 43 | 9 | 180 |
| 1 | 1 | 0 | 7,4 | 1,3 | 20 | 3 | 1 | 1 | 74 | 17 | 200 |
| 1 | 1 | 1 | 11 | 3,6 | 38 | 3 | 1 | 2 | 120 | 37 | 420 |
| 1 | 2 | 0 | 11 | 3,6 | 42 | 3 | 1 | 3 | 160 | 40 | 420 |
| 1 | 2 | 1 | 15 | 4,5 | 42 | 3 | 2 | 0 | 93 | 18 | 420 |
| 1 | 3 | 0 | 16 | 4,5 | 42 | 3 | 2 | 1 | 150 | 37 | 420 |
| 2 | 0 | 0 | 9,2 | 1,4 | 38 | 3 | 2 | 2 | 210 | 40 | 430 |
| 2 | 0 | 1 | 14 | 3,6 | 42 | 3 | 2 | 3 | 290 | 90 | 1000 |
| 2 | 0 | 2 | 20 | 4,5 | 42 | 3 | 3 | 0 | 240 | 42 | 1000 |
| 2 | 1 | 0 | 15 | 3,7 | 42 | 3 | 3 | 1 | 460 | 90 | 2000 |
| 2 | 1 | 1 | 20 | 4,5 | 42 | 3 | 3 | 2 | 1100 | 180 | 4100 |
| 2 | 1 | 2 | 27 | 8,7 | 94 | 3 | 3 | 3 | >1100 | 420 | -- |
| SUMBER : Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 8th edition, 1998 | |||||||||||