Tahap-Tahap Uji Salmonella (SNI-01-2332.2-2006)

A. Tahap pra-pengkayaan

Metoda ini didasarkan pada analisa 25 g atau 225 ml contoh dengan perbandingan 1 : 9 untuk contoh dan media pengkayaan (lactose broth = LB). contoh yang akan diuji , kemudian di masukkan dalam wadah atau plastik stomacher steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth (LB). Homogenkan contoh (Stomacher) selama 2 menit untuk dianalisa. Secara aseptis, pindahkan larutan contoh dalam wadah steril yang sesuai. Inkubasi 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Lanjutkan pengujian sesuai dengan prosedur.

 Sampel Tuna sebelum ditimbang

Sampel Tuna setelah ditimbang, siap di uji pada tahap Pra-Pengkayaan

                                                        (25 g sampel + 225 ml Lactose Broth)

 Tahap Pra-Pengkayaan sebelum diinkubasi

                                             Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35^oC

        

B.  Tahap pengkayaan

Kencangkan tutup wadah dan kocok perlahan contoh yang diinkubasi. Untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, pindahkan 0,1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan contoh ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); Untuk jenis produk perikanan lain, pindahkan 1 ml larutan contoh ke dalam masing-masing 10 ml SCB dan 10 ml TTB

    Tahap Pengkayaan: dari contoh pra-pengkayaan ke media pengkayaan 

TTB dan RV.  Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada Waterbath 

suhu 43^oC (untuk TTB) dan 42^oC (untuk RV)

Inkubasi media pengkayaan selektif sebagai berikut:

inkubasi RV medium selama 24 jam± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C (Water bath);

Inkubasi TTB selama 24 jam ± 2 jampada suhu 43°C ± 0,2°C (Water bath);

inkubasi TTB dan SCB selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C (Inkubator).

C. Tahap Isolasi  

Kocok tabung (dengan vortex) dan dengan mengggunakan jarum loop (3mm) gores TTB yang diinkubasi ke dalam media HE, XLD dan BSA. Siapkan BSA sehari sebelum digunakan dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Gores ke dalam media yang sama dari RV Broth atau SCB.  Inkubasi cawan BSA, HE dan XLD selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C.  Amati kemungkinan adanya koloni Salmonella.

D.  Pengamatan morfologi Salmonella

Ambil 2 atau lebih koloni Salmonella dari masing-masing media Agar selektif setelah 24 jam± 2 jam inkubasi. Koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) adalah sebagai berikut:

• Pada Hectoen Enteri (HE) Agar. Koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
• Pada XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
• Pada Bismuth Sulphite Agar (BSA). Koloni coklat, abu-abu atau hitam; kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam (halo effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi.

 Koloni positif pada media selektif
 HE (atas), BSA (kiri), dan XLD (kanan)

Koloni negatif pada media selektif

HE (atas), BSA (kiri), dan XLD (kanan)

 Media TSI (merah) dan LIA (ungu) sebelum diinkubasi

 LIA dan TSI positif setelah diinkubasi

• Ambil secara hati-hati bagian tengah koloni dengan menggunakan jarum inokulasi steril dan goreskan ke permukaan media TSI agar dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Tanpa mengambil koloni baru, gunakan jarum yang sama untuk menggores media LIA dengan cara menusuk agar tegak lebih dahulu, setelah itu goreskan pada agar miring. 
• Inkubasi TSI dan LIA selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C dengan membiarkan tutup sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H2S yang berlebihan. Pada TSI, kultur Salmonella yang khas memberikan reaksi alkalin (merah) pada goresan agar miring dan asam (kuning) pada tusukan agar tegak, dengan atau tanpa H2S (warna kehitaman pada agar). Pada LIA, kultur Salmonella yang khas memberikan reaksi alkaline (ungu) pada keseluruhan tabung. Reaksi yang benar-benar kuning pada tusukan dinyatakan sebagai kultur negatif. Jangan hanya melihat diskolorisasi pada tusukan untuk menyatakan kultur negatif. Umumnya kultur Salmonella membentuk H2S pada LIA. Beberapa kultur non Salmonella membentuk reaksi merah bata pada agar miring LIA. Reaksi TSI dan LIA dapat dilihat pada Tabel 1. di bawah ini:

                             Tabel 1. Reaksi biokimia Salmonella pada TSI dan LIA

Media	Agar Miring (goresan)	Agar Tegak (tusukan)	Gas	H­2S
TSI	Alkalin / K (merah)	Asam / A (kuning)	+ /-	+ /-
LIA	Alkalin / K (ungu)	Alkalin / K (ungu)	+/-	+

E. Identifikasi Salmonella

• Uji Urease

Pindahkan 1 ose penuh dari  TSI Agar miring ke dalam Urea Broth. Inkubasikan selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

Reaksi positif Salmonella: Urease(-), Indol (-), Dulcito (+), 

                                                  Lactose (-), Sukrose (-) dan Citrat (SCA) positif
 

• Uji Biokimia

a.    Purple Broth base dengan 0,5% Dulcitol

Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media dulcitol Broth. Kendurkan tutupnya dan inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Pada umumnya Salmonella memberikan hasil positif, ditandai dengan pembentukan gas dalam tabung durham dan pH asam (kuning) pada media. Reaksi negatif ditandai dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna ungu (bromocresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

b.    Tryptone Broth (TB)

Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media Tryptone Broth. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C dan selanjutnya ikuti prosedur di bawah ini:

Ø  Potasium Cyanida (KCN) Broth

Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media KCN Broth. Tutup tabung rapat-rapat dan lapisi dengan kertas parafilm. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C tetapi amati setelah 24 jam. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan (ditandai dengan adanya kekeruhan). Umumnya Salmonella tidak tumbuh pada media ini yang ditandai dengan tidak terjadinya kekeruhan.

Ø  Malonate Broth

Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media Malonate Broth. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Kadang-kadang tabung Malonate Broth yang tidak diinokulasi berubah menjadi biru. Oleh karena itu gunakan Malonate Broth sebagai kontrol. Reaksi positif ditandai dengan perubahan warna menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan reaksi negatif (hijau atau tidak ada perubahan warna) pada Broth ini.

Ø  Uji Indol

Pindahkan 5 ml TB 24 jam kedalam tabung kosong dan tambahkan 0,2 ml – 0,3 ml Reagent kovacs’. Amati segera setelah penambahan Reagen. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin merah pada permukaan media. Umumnya Salmonella memberikan reaksi negatif (tidak terbentuk cincin merah pada permukaan media). 

 

Indol negatif (kiri) dan Indol positif (kanan)

reaksi Salmonella: Indol negatif

                   Reaksi positif Salmonella: KCN negatif dan Malonate negatif

• Uji Serologi Polyvalent Somatic (O)

Ambil 1 ose kultur dari TSI (dari butir 8.3f) yang telah diinkubasikan selama 24 jam – 48 jam dan letakkan diatas gelas preparat, kemudian tetesi dengan larutan saline 0,85% steril dan emulsikan. Letakkan 1 tetes Salmonella Polyvalent Somatic (O) Antiserum disamping suspensi koloni. Campurkan koloni Antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Lakukan kontrol dengan menggunakan larutan saline dan Antiserum. Miringkan campuran tersebut ke kiri dan ke kanan, dan amati segera pada latarbelakang yang gelap. Amati hasil uji sebagai berikut:

Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol.

Negatif apabila tidak terjadi penggumpalan baik pada larutan kultur maupun larutan kontrol.

 

• Uji Biokimia Tambahan

Lakukan uji biokimia tambahan jika pada biakan tidak dapat diklasifikasikan sebagai Salmonella sp.

a.    Purple Lactose Broth

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam phenol red lactose atau purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.

Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

b.    Purple Sucrose Broth

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam kedalam Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam.

Positif, apabila terjadi pembentukan asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam, maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif, ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah (phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh media.

C.   Medium MR-VP

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

Ø  Lakukan Uji VP

Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C ke dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan kembali MR-VP Broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C untuk pengujian Methyl Red. Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok. Tambahkan 0,2 ml larutan 40% KOH dan kocok kembali. Untuk mempercepat reaksi tambahkan sedikit Kristal kreatin, dan amati hasilnya setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi positif.Umumnya Salmonella memberikan reaksi VP negatif.

Ø  Lakukan Uji MR

Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP yang telah diinkubasi selama 96 jam. Amati hasilnya dengan segera. Umumnya Salmonella memberikan reaksi positif, ditandai dengan terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning menunjukkan reaksi negatif.

              VP negatif (kiri) dan VP positif (kanan)

           Reaksi positif Salmonella: VP negatif

 

                                                 MR negatif (kiri) dan MR positif (kanan)

Reaksi positif Salmonella: MR positif

d.   Simmon Citrat Agar

Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agar miring dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

Positif, apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti dengan perubahan warnadari hijau menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan hasil citrate positif.

Negatif, apabila tidak ada atau sedikit sekali pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna.

Tabel 2.  Reaksi Biokimia Salmonella

No.	Pengujian	Hasil Reaksi		Reaksi Salmonella sp
		Positif	Negatif
1	Glukosa (TSI)	Tusukan kuning	Tusukan merah	Positif
2	Lysine Decarboxylase (LIA)	Tusukan ungu	Tusukan ungu	Positif
3	H2S (TSI dan LIA)	Hitam	Tidak hitam	Positif
4	Urease	Warna ungu sampai merah	Tidak ada perubahan warna	Negatif
5	Lysine Decarboxylase Broth (LDB)	Warna ungu	Warna kuning	Positif
6	Dulcitol Broth	Warna kuning atau ada gas	Tidak ada perubahan warna dan gas	Positif b
7	KCN Broyh	Pertumbuhan	Tidak ada pertumbuhan	Negatif
8	Malonate Broth	Warna biru	Tidak ada perubahan warna	Negatif C
9	Uji Indol	Warna violet pada permukaan	Warna kuning pada permukaan	Negatif
10	Uji Serologi Polyvalent  Flagellar (H)	Penggumpalan	Tidak ada penggumpalan	Positif
11	Uji Serologi Polyvalent Somatic (O)	Penggumpalan	Tidak ada penggumpalan	Positif
12	Lactose Broth	Warna kuning atau ada gas	Tidak ada perubahan warna dan gas	Negatif C
13	Sucrose Broth	Warna kuning atau ada gas	Tidak ada perubahan warna dan gas	Negatif
14	Uji Voges Proskauer (VP)	Merah muda sampai merah	Tidak ada perubahan warna	Negatif
15	Uji Methyl Red (MR)	Warna merah menyebar	Warna kuning menyebar	Positif
16	Simmons Citrate	Ada pertumbuhan, warna biru	Tidak ada pertumbuhan dan perubahan warna	Variabel

Catatan:

^a +, 90% atau lebih positif dalam 1 atau 2 hari;

-, 90% atau lebih negatif dalam 1 atau 2 hari;

v, variabel

^b Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Negatif

^C Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Positif

Tabel 3.  Kriteria untuk kultur non Salmonella

No.	Pengujian	Hasil (non Salmonella)
1	Urease	Positif (warna ungu sampai merah)
2	Uji Indol dan Polyvalent Flagellar (H)	Positif (warna merah pada permukaan Negatif (tidak ada penggumpalan)
3	LDB dan KCN	Negatif (warna kuning) Positif (ada pertumbuhan)
4	Lactose Broth	Positif (warna kuning ada gas) a,b
5	Sucrose Broth	Positif (warna kuning ada gas) b
6	Uji VP Uji MR	Positif (merah muda sampai merah) Negatif (warna kuning menyebar)

Dengan:

^a Uji Malonate Broth positif lebih lanjut untuk menentukan jika biakan tersebut Salmonella arizonae.

Lakukan uji Malonate Broth untuk menentukan adanya Salmonella arizonae

^b Jangan membuang kultur Broth yang positif jika LIA menunjukkan reaksi Salmonella yang khas; lakukan pengujian lebih lanjut untuk menentukan adanya bakteri Salmonella.