1. Prinsip
Contoh yang diuji ditumbuhkan terlebih dahulu pada media pengkayaan dan dideteksi dengan menumbuhkan pada media agar selektif. Koloni-koloni yang diduga Vibrio cholera pada media agar selektif diisolasi kemudian dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji biokimia dan uji serologi untuk meyakinkan ada atau tidaknya Vibrio cholerae.
Vibrio cholerae (V. cholerae) merupakan bakteri gram-negatif, berbentuk batang pendek atau koma, dapat memfermentasi sukrosa pada media TCBS dan dapat bergerak karena adanya flagela polar.
2. Peralatan
- stomacher beserta plastik steril
- cawan petri ukuran 15 mm x 100 mm
- tabung reaksi ukuran 16 mm x 125 mm dan ukuran 13 mm x 100 mm
- timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g dan 0,0001 g
- inkubator 36°C ± 1°C
- waterbath 42°C ± 0,2°C
- autoclave 121°C
- jarum inokulasi dan jarum ose
- bunsen
- pH meter
- peralatan sterilisasi filter
- oven
- pipet atau pippetor 1 ml, 5 ml dan 10 ml
- mikroskop;
- Hot plate dilengkapi dengan magnetic stirer;
- alat pengocok (Vortex mixer)
3. Media dan Pereaksi
- Alkaline Peptone Water (APW)
- Alkaline Peptone Salt (APS)
- Decarboxylase basal medium dengan penambahan suplemen arginine, lysine dan
ornithine secara individual
- Kliger Iron Agar (KIA)
- Motility Test Medium (MTM), semisolid
- MR-VP broth
- Purple Broth Base (PBB) dengan penambahan suplemen sucrose, lactose, cellobiose,
arabinose, D-mannitol atau D-mannose secara individual
- OF medium semisolid dengan penambahan suplemen glucose, sucrose, lactose,
cellobiose, arabinose, D-mannitol atau D-mannose secara individual
- Triple Sugar Iron (TSI) agar
- Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose (TCBS) agar
- Trypticase (tryptic) Soy Broth (TSB)
- Trypticase (tryptic) Soy Agar (TSA)
- Tryptone Broth and Tryptone Salt Broths (T1No, T1N1, T1N3, T1N6)
- Urea broth
- Pereaksi kovacs
- Mineral atau parafin oil steril
- O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine) disk, 10 μg dan 150 μg
- ONPG disk
- Pereaksi oksidase
- HCl 1N
- Physiological saline 0,85%
- Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7,4
- NaCl 2% dan 3%
- Larutan NaOH 1N
- Pereaksi VP
- Pereaksi pewarnaan Gram
- Anti serum Poly Hikojima Inaba – Ogawa.
4. Prosedur Pengujian
Pengkayaan
a. Timbang secara aseptis 25 g contoh kemudian tambahkan 225 ml larutan Alkaline Pepton Water (APW). Homogenasi selama 2 menit - 3 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 1 : 10.
b. Siapkan 1 set pengenceran dengan cara melarutkan 1 ml Homogenat di atas kedalam 9 ml APW. Lakukan pengenceran sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Inkubasi pada suhu 36°C ± 1°C selama 16 jam - 24 jam. Goreskan larutan pengkayaan (APW) ke TCBS agar.
Isolasi V.cholerae
a. Tanpa mengocok tabung, ambil 1 ose dari setiap tabung yang positif (keruh) pada setiap pengenceran sedalam 1 cm dari permukaan cairan dan goreskan ke dalam TCBS agar. Inkubasikan TCBS agar pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam - 24 jam.
b. Amati keberadaan V. cholerae pada TCBS agar. Koloni V. cholerae besar, permukaan halus, agak datar, bagian tengah buram dan bagian pinggir terang, berwarna kuning (sukrosa positif).
Koloni V.cholerae pada media TCBS
Pemurnian
Secara hati-hati ambil 3 koloni terduga atau lebih dari setiap TCBS agar, goreskan ke dalam tabung TSA miring + 1,5% NaCl (total mengandung NaCl 2%). Inkubasikan selama 18 jam – 24 jam pada suhu 36°C ± 1°C.
Media TSA slant
Uji Oksidasi
Goreskan 1 ose dari TSA miring + NaCl 1,5 % atau medium lain yang tidak memfermentasi karbohidrat ke dalam cawan petri yang berisi TSA agar. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam – 24 jam. Teteskan 2 – 3 tetes pereaksi oksidase pada koloni bakteri dan amati reaksinya. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua pada koloni. Uji oksidase dapat juga dilakukan dengan menggunakan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua secara cepat.
Uji sensitifitas terhadap 0 / 129 vibriostat
Goreskan 1 ose dengan cepat dari TSA miring + NaCl 1,5 % ke dalam cawan petri yang berisi TSA dengan rapat. Letakkan disk 0/129 10 μg dan 150 μg pada goresan yang paling rapat dan inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam – 24 jam. Amati pertumbuhan disekitar disk. Reaksi sensitif ditunjukkan dengan terbentuknya zona disekitar disk (S), sedangkan reaksi resisten ditandai dengan adanya pertumbuhan disekeliling disk (R). V. cholerae sensitif terhadap 0 / 129 10 μg dan 150 μg.
Uji sensitifitas
Triple Sugar Iron (TSI) Agar dan Kligger Iron Agar (KIA)
Inokulasikan koloni dari TSA miring + NaCl 1,5 % dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar tegak media TSI agar dan KIA. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam – 24 jam. V. cholerae menghasilkan asam (warna kuning) pada agar miring, asam (warna kuning) pada agar tegak dan tidak menghasilkan gas serta H2S. Reaksi Vibrio spp dalam beberapa media agar miring yang berbeda dapat dilihat pada Tabel 1.
Reaksi Vibrio cholera: TSI (Asam/Asam=A/A) dan KIA (Alkaline/Asam=K/A)
(Asam=kuning & Alkaline=merah)
Tabel 1. Reaksi Vibrio spp dalam media agar miring KIA dan TSI
Bakteri | KIA | TSI | ||
agar miring | agar tegak | agar miring | agar tegak | |
V. cholerae | K | A | A (K jarang) | A |
V. mimicus | K | A | K (A jarang) | A |
V. parahaemolyticus | K | A | K | A |
V. alginolyticus | K | A | A | A |
V. vulnificus | K atau A | A | K (jarang) | A |
A. hydrophilia | K atau A | A | K atau A | A |
P. shigeloides | K atau A | A | K atau A | A |
Sumber : BAM, FDA, 1998 | ||||
CATATAN : K adalah alkaline A adalah asam | ||||
Uji ONPG
Untuk uji ONPG gunakan kultur dari TSI atau media lain yang mengandung lactose. Inokulasikan 1 ose kultur dari TSI ke dalam tabung yang berisi 0,5 ml larutan physiological saline. Masukkan 1 disk ONPG lalu inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 20 menit sampai dengan 1 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada media dalam tabung.
Reaksi ONPG negatif (kiri) dan Positif (kanan)
Uji oksidatif – fermentatif (OF)
Inokulasikan 2 tabung kedalam media OF yang telah ditambahkan glukosa 1% dengan kultur dari TSA miring + 1,5 % NaCl. Tambahkan mineral oil steril setinggi 1 cm - 2 cm kedalam salah satu tabung. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 1 hari - 2 hari. Reaksi oksidatif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning (reaksi asam) pada tabung yang tidak ditambahkan dengan mineral oil, sedangkan reaksi fermentatif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada tabung yang ditambahkan mineral oil. Asam mengubah media dari warna hijau menjadi kuning.
Uji OF: 2 tabung kiri positif (kuning) dan 2 tabung kanan negatif (hijau)
Pewarnaan gram
Buat pewarnaan gram dari setiap koloni terduga V. cholerae. Kultur diambil dari TSA miring + NaCl 1,5 % yang telah diinkubasikan selama 24 jam. Bakteri V. cholerae termasuk gram-negatif, berbentuk batang pendek atau koma.
6. Uji biokimia lanjutan
Lanjutkan pengujian apabila pada uji biokimia pendahuluan diatas ditemukan reaksi V. cholerae yang khas (Tabel 1). Goreskan kembali kultur dari TSA miring + NaCl 1,5 % ke TSA miring NaCl 1,5 % yang baru dan TSB. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam - 24 jam.
Uji hidrolisis Urea.
Inokulasikan 1 ose dari TSA miring + NaCl 1,5% ke dalam media Urea. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 18 jam. Reaksi positip ditunjukan dengan perubahan warna media dari orange menjadi merah muda. Vibrio cholerae tidak mempunyai kemampuan dalam menghidrolisis Urea (reaksi negatif).
Urea broth (negatif)
Uji Arginin dihydrolase, Lysine dekarboksilase, dan ornithin dekarboksilase.
Inokulasikan kultur dari TSA miring + 1,5% NaCl kedalam 3 tabung media dasar dekarboksilase
yang masing-masing mengandung arginin, lysine dan ornithin serta kedalam 1 tabung kontrol media dasar dekarboksilase yang tidak mengandung asam amino. Tambahkan masing-masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 4 hari. Lakukan pengamatan setiap hari. Reaksi dekarboksilase terhadap asam amino menghasilkan pH alkaline dan mengubah media menjadi ungu cerah (reaksi positif). Sedangkan reaksi fermentasi glukosa menghasilkan asam dan mengubah media menjadi warna kuning (reaksi negatif). Tabung kontrol yang tidak mengandung asam amino berubah menjadi kuning. V. cholerae menghasilkan reaksi arginin dihydrolase negatif, lysine dan ornithin positif dan ornithin Decarboxylase positif.
Dari Kiri ke Kanan: Arginine(-), Lysine(+), Ornithin(+), Sucrose(+), Lactose(-),
Arabinose(-), Mannose(-) , Mannitol(+)
Uji toleransi terhadap garam
Inokulasikan kultur dari TSB kedalam 4 tabung yang masing-masing mengandung Tryptone Broth 1% yang ditambahkan NaCl 0%; 1%; 3%; dan 6% (T1N0, T1N1, T1N3, T1N6 ). Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C, selama 18 jam – 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan terjadinya kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan. V. cholerae tumbuh dalam media T1N0, T1N1, T1N3, tetapi tidak tumbuh dalam media T1N6 (Tabel 2).
Uji pertumbuhan pada suhu 42oC
Inokulasikan 1 ose dari TSB yang telah diinkubasikan selama 24 jam kedalam TSB yang telah dihangatkan dalam Waterbath 42°C. Inkubasikan pada suhu 42°C dalam Waterbath selama 24 jam. Reaksi positif ditandai dengan terjadinya kekeruhan yang menunjukkan adanya pertumbuhan. V.cholerae mampu tumbuh pada suhu 42°C (Tabel 2).
Uji voges-proskauer
Inokulasikan 1 ose dari TSA miring + 1,5% NaCl kedalam MR-VP broth Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 2 hari. Pindahkan 1 ml dari setiap MR-VP broth yang menunjukkan pertumbuhan ke dalam tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril. Tambahkan 0,6 ml larutan alphanaphtol dan 0,2 ml KOH 40% lalu kocok. Tambahkan sedikit kristal keratin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah muda sampai merah mirah delima (ruby) pada media. V. cholerae menghasilkan reaksi variabel.
Uji fermentasi karbohidrat.
Inokulasikan 1 ose dari TSA miring + 1,5% NaCl kedalam masing-masing satu tabung Purple broth Base yang mengandung sucrose, lactose, D-mannitol, mannosa, arabinosa atau cellobiose. Tambahkan masing-masing tabung dengan mineral oil steril setinggi 1 cm – 2 cm. Inkubasikan pada suhu 36°C ± 1°C selama 4 hari - 5 hari dan lakukan pengamatan setiap hari. Reaksi positif fermentasi karbohidrat menghasilkan asam dan mengubah media menjadi kuning (Tabel 2).
Uji serologi
Ambil 1 ose kultur dari T1N1 agar atau TSA + 1,5% NaCl yang telah diinkubasikan selama 16 jam -24 jam dan letakkan diatas gelas preparat. Tetesi dengan larutan saline 0,85% dan emulsikan. Letakkan 1 tetes antiserum Poly Hikojima Inaba-Ogawa disamping suspense koloni. Campurkan antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Lakukan kontrol dengan menggunakan laruran saline dan antiserum. Goyangkan campuran tersebut ke kiri dan ke kanan dan amati reaksi penggumpalan pada latar belakang yang gelap sebagai berikut:
Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol.
Negatif apabila tidak terjadi penggumpalan baik pada larutan kultur maupun larutan kontrol.
7. Interpretasi hasil
Tabel 2. Kharakteristik minimal uji biokimia untuk identifikasi V. cholera
No. | Jenis Uji | Interpretasi Hasil |
1 | Morfologi | Gram-negatif, bentuk batang atau koma |
2 | TSI | Agar miring: asam (kuning) Agar tegak: asam (kuning) |
3 | Oksidatif / fermentatif (media OF) | Oksidatif positif dan Fermentatif positif |
4 | Oksidase | Positif |
5 | Arginin dehidrolase | Negatif |
6 | Lysine dekarboksilase | Positif |
7 | VP | Variable |
8 | Pertumbuhan pada suhu 42°C | Positif |
9 | Halophilik | T1N 0 : positif; T1N1 = positif; T1N3 = positif T1N6 : negatif |
10 | Fermentasi sucrose | Positif |
11 | ONPG | Positif |
12 | Fermentasi arabinose | Negatif |
13 | Sensitifitas terhadap 0 / 129 | Sensitif (S) terhadap 10 μ g dan 150 μg |
8. Pelaporan hasil
Laporkan ada (positif) atau tidak (negatif) Vibrio cholerae berdasarkan uji biokimia dan serologi.
