Penentuan Total Plate Count (Angka Lempeng Total) (SNI 01-2332.3-2006)

1.  Prinsip

Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anerob (psikrofilik, mesofilik, dan termofilik) setelah contoh diinkubasi dalam media agar pada suhu 35^oC ±1^oC selama 48 jam ±1 jam.  Mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembangbiak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung.

Penentuan Angka Lempeng Total (ALT) dapat dilakukan dengan dua cara.  Pertama dengan metode agar tuang (pour plate) yaitu dengan menanamkan contoh ke dalam cawan petri terlebih dahulu kemudian ditambahkan media agar, kedua  metode agar sebar (spread plate) yaitu dengan menuangkan terlebih dahulu media agar ke dalam cawan petri kemudian contoh diratakan pada permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok.

Catatan: Pada laboratorium mikrobiologi BPPMHP Makassar, penentuan ALT menggunakan cara pertama (metode agar tuang).

2.  Peralatan

- Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g                   

- Autoclave

- Inkubator 35 ^o C

- Cawan Petri 15 mm x 90 mm

- Tabung reaksi

- Alat Penghitung Koloni (Colony Counter)

- Stomacher

- Vortex

- Pipet gelas atau pipetor :1 ml

3.  Media dan Pereaksi

·  Plate Count Agar (PCA)

·  Larutan Butterfield’s phosphate buffered (BFP)

4. Kondisi 

Pada metode cawan agar tuang, untuk menghindari berkurangnya populasi bakteri akibat panas yang berlebihan maka media agar yang akan dituang mempunyai suhu 45^oC ± 1^oC.

5.  Preparasi Contoh

Timbang contoh secara aseptis sebanyak 25 g kemudian masukkan ke dalam wadah plastik steril.  Tambahkan 225 ml larutan BFP.  Homogenkan dengan menggunakan alat Stomacher selama 2 menit.  Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10^-1.  Dengan menggunakan pipet steril, ambil 1 ml homogenat di atas dan masukkan ke dalam tabung yang berisi 9 ml larutan BFP untuk mendapatkan pengenceran 10^-2.  Siapkan pengenceran selanjutnya (10^-3) dengan mengambil 1 ml contoh dari pengenceran 10^-2 ke dalam 9 ml BFP.  Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.  Selanjutnya lakukan hal yang sama untuk pengenceran 10^-4, 10^-5 dst. sesuai kondisi contoh.

6.  Prosedur

a.  Pipet 1 ml dari setiap pengeceran 10^-1, 10^-2,dst dan masukkan ke dalam cawan Petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.

b.  Tambahkan12 ml-15ml PCA yang suah di dinginkan dalam waterbath hingga mencapai suhu 45 ^OC ± 1 ^oC ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan.

    Catatan : Untuk pengujian bakteri Termofilik,penamabahan media  PCA ke dalam   cawan sebanyak 40 ml - 50 ml.

c.  Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisis terbalik dalam incubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35 ^OC ( Mesofilik ).

d.  Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer dengan media PCA.

Pengujian ALT dilakukan dalam Lamainar Air Flow

Penghitungan jumlah bakteri pada tiap cawan petri 

menggunakan alat Colony Counter

 

7. Pembacaan dan perhitungan koloni pada cawan Petri.

1.    Cawan yang mengandung jumlah 25 koloni-250 koloni dan bebas spreader.

       Catat pengenceran yang digunakan dan hitung jumlah total koloni.  Perhitungan Angka Lempeng Total sebagai berikut :

           

           ∑C

N = -------------------------------------

        [(1 x n₁) + (0,1 x n₂)] x (d)

       Dengan :

N adalah jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni  per ml atau koloni per g.

∑C adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung

n₁  adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung

n₂  adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung

d   adalah pengenceran pertama yang dihitung.

CONTOH :

Pengenceran                  :               1:100                                     1:1000

Jumlah Koloni                 :               232 dan 244                        33 dan 28

            (232 + 244 + 33 + 28)

N =  -------------------------------------

        [(1 x 2) + (0,1 x 2)] x (10^-2)

                                               

= 537 / [(2 + 0,2)] x (0,01)

                                                = 537 / (2,2 x 0,01)

= 537 / 0,022

= 24.409

= 24.000

=  2.4 x 10⁴ kol/g

8.  Pelaporan

·     Untuk menghasilkan perhitungan yang akurat dan teliti, maka laporkan hasilnya   dengan dua angka ( digit ) pertama sebagai hasil pembulatan.

·     Bulatkan keatas dengan cara menaikkan angka edua menjadi angka yang lebih tinggi bila angka ketiga adalah 6,7,8 atau 9 dan gunakan angka 0 untuk masing-masing angka pada digit berikutnya.

·     Bulatkan kebawah bila angka ketiga adalah 1,2,3 atau 4. Bila angka ketiga 5, bulatkan keatas bila angka kedua ganjil dan bulatkan kebawah bila angka kedua itu genap.