Tahap-Tahap Pengujian Escherichia coli (SNI 01-2332.1-2006)

1.  Ruang Lingkup

Standar ini digunakan untuk menentukan bakteri indicator sanitasi (Coliform dan E.coli) pada produk perikanan.

2.  Istilah dan Definisi

Coliform

bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik.

Faecal Coliform

kelompok bakteri fakultatif aerob, gram negatif tidak membentuk spora, berbentuk batang

pendek, mampu memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas serta tumbuh pada suhu 45^oC + 0,5^oC selama sekurang-kurangnya 24 jam.

E. coli

bakteri gram negatif yang berbentuk batang pendek atau coccus, tidak membentuk spora.

3.  Peralatan

a) waterbath bertutup dengan sirkulasi 45^oC + 0,5^oC;

b) inkubator 35^oC ± 1^oC;

c) blender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher;

d) botol pengencer;

e) tabung durham;

f) cawan petri ukuran 15 mm x 90 mm;

g) tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100 mm;

h) timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;

i) mikroskop;

j) pipet atau pippetor 1ml, 5 ml dan 10 ml.

5 Media dan pereaksi

a) Brilliant Green Lactose Bile (BGLB), 2 % Broth

b) Lauryl Tryptose Broth (LTB)

c) EC Broth

d) Levine’s Eosin Methylen Blue (L-EMB ) agar

e) Tryptone (Tryptophane) Broth (TB)

f) MR-VP Broth

g) Simmon Citrate Agar

h) Plate Count Agar

i) Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered (BFP)

j) Pereaksi Kovacs

k) Pereaksi VP

l) Indikator MR

m) Pereaksi pewarnaan gram

6.  Persiapan Contoh

Timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji , kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan BFP. Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan dengan pengenceran 10^-1.

7.  Tahap analisa

Uji pendugaan coliform (Presumptive coliform)

a) Siapkan pengenceran 10^-2 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10^-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer BFP. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.

b) Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, sebanyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri tabung lauryl tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham.

c) Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 1^oC. Perhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

d) Lakukan “Uji penegasan coliform” untuk tabung-tabung positif.

 

 Tabung-tabung LTB sebelum diinkubasi

 

Tabung-tabung LTB positif

Uji penegasan coliform (confirmed coliform)

a) Inokulasikan tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi BGLB Broth yang telah diinokulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ±1^oC.

b) Periksa tabung-tabung BGLB yang menghasilkan gas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ±1^oC. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

c) Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung BGLB yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g coliform”

 

Tabung-tabung BGLB Positif

Uji pendugaan Escherichia coli (faecal coliform, presumptive Escherichia coli)

a) Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi EC Broth dalam waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45^oC ± 0,5^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.

b) Periksa tabung-tabung EC Broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

c) Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai “APM/g faecal coliform”.

  

Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli)

a) Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke LEMB agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC + 1^oC.

b) Koloni Escherichia coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik.

c) Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escherichia coli dari masing-masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC+ 1^oC.

d) Jika koloni yang khas (typical ) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli ke media PCA miring.

 

 Media Selektif LEMB Agar (Positif)

Uji morfologi

Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherichia coli

terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek.

8.  Uji biokimia

Produksi indol ( I )

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone Broth inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC +1^oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml – 0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

Uji voges proskauer (VP)

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC +1^oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH, kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby).

 

Uji methyl red (MR)

Inkubasikan kembali MRVP Broth di atas selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC +1^oC. Tambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.

 

Uji sitrat (C)

Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan simmon citrat agar. Inkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35^oC +1^oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

 

Produksi gas dari laktosa

Inokulasikan 1 ose dari PCA miring kedalam LTB. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC +1^oC V.VC         reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham.

                                                                                            

9.  Interpretasi Hasil

Tabel 1.  Interpretasi hasil

Kriteria	Biotipe 1	Biotipe 2
Gas pada tabung LTB	+	+
Indol	+	-
MR	+	+
VP	-	-
Citrat	-	-
Uji Morfologi	Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora	Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora

10.  Pelaporan

Berdasarkan interpretasi hasil di atas, nyatakan coliform dan Escherichia coli dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). 

Tabel 2.  Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif dari 3 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2 dan 10 3

Tabung positif			APM/g	Tingkat kepercayaan		Tabung  positif			APM/g	Tingkat kepercayaan
101	102	103		Bawah	Atas	101	102	103		Bawah	Atas
0	0	0	<3,0	-	9,5	2	2	0	21	4,5	42
0	0	1	3,0	0,15	9,6	2	2	1	28	8,7	94
0	1	0	3,0	0,15	11	2	2	2	35	8,7	94
0	1	1	6,1	1,2	18	2	3	0	29	8,7	94
0	2	0	6,2	1,2	18	2	3	1	36	8,7	94
0	3	0	9,4	3,6	38	3	0	0	23	4,6	94
1	0	0	3,6	0,17	18	3	0	1	38	8,7	110
1	0	1	7,2	1,3	18	3	0	2	64	17	180
1	0	2	11	3,6	38	3	1	0	43	9	180
1	1	0	7,4	1,3	20	3	1	1	74	17	200
1	1	1	11	3,6	38	3	1	2	120	37	420
1	2	0	11	3,6	42	3	1	3	160	40	420
1	2	1	15	4,5	42	3	2	0	93	18	420
1	3	0	16	4,5	42	3	2	1	150	37	420
2	0	0	9,2	1,4	38	3	2	2	210	40	430
2	0	1	14	3,6	42	3	2	3	290	90	1000
2	0	2	20	4,5	42	3	3	0	240	42	1000
2	1	0	15	3,7	42	3	3	1	460	90	2000
2	1	1	20	4,5	42	3	3	2	1100	180	4100
2	1	2	27	8,7	94	3	3	3	>1100	420	--
SUMBER : Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 8th edition, 1998