Penentuan Staphylococcus aureus (SNI 01-2332.9-2011) Pada Produk Perikanan

Penentuan Staphylococcus aureus  Pada Produk 
Perikanan (SNI 01-2332.9-2011) Dengan Metode Cawan Hitung (Plate Count) - Kuantitatif

1.      Prinsip

Metode cawan hitung agar sebar dengan cara menuangkan media Baird Parker Agar (BPA) ke dalam cawan petri steril, biarkan membeku, kemudian contoh sebanyak 1 ml disebar di atas permukaan media.  Konfirmasi koloni terduga (suspect) S. aureus dilakukan dengan uji koagulase dan uji tambahan.  Metode ini sesuai untuk menganalisa makanan yang diduga mengandung lebih dari 100 koloni S. aureus per gram.

2.      Peralatan

-          Autoclave

-          Inkubator 35^oC ±1^oC

-          Timbangan analitik dengan ketelitian 0.0001 g

-          Tabung reaksi

-          Cawan petri 15 mm x 90 mm

-          Colony Counter

-          Stomacher dan plastik stomacher

-          Batang gelas bengkok diameter 3 mm–4 mm, dengan panjang tangkai 15 cm–20 cm

-          Pipet gelas atau micro pipette 0.1 ml dan 1 ml

-          Gelas ukur 250 ml

-          Gelas preparat

-          Membran apparatus

-          Membran filter

-          Erlenmeyer 500 ml

-          Waterbath

3.      Media dan Pereaksi

-          Baird Parker Agar (BPA)

-          Brain Heart Infusion (BHI) broth

-          Purple carbohydrate broth (masing-masing mengandung glucose dan manitol 0.5%)

-          Toluidine Blue-DNA Agar

-          Coagulase plasma (Rabbit) dengan EDTA

-          Parafin oil steril

-          Larutan BFP (Butterfield’s Phosphate) buffered

-          Pereaksi Katalase (3% H₂O₂)

-          Pereaksi pewarnaan gram

-          Trypticase (tryptic) Soy Agar

 Metode Pengujian

1.      Kondisi Pengujian

Selama melakukan pengujian, terapkan teknik aseptis dan lakukan pengujian di ruangan atau Laminar air flow yang terkontrol.  Media BPA dalam petri yang akan digunakan harus dalam keadaan kering.  Bila koloni S. aureus belum tumbuh dengan baik setelah 48 jam, inkubasi kembali sampai 72 jam sebelum dilakukan perhitungan.

2.      Prosedur

Timbang contoh secara aseptic sebanyak 25 g, kemudian masukkan ke dalam wadah plastik stomacher steril.  Tambahkan 225 ml larutan BFP, homogenkan selama 2 menit.  Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10¹.  Dengan menggunakan pipet steril, ambil 1 ml homogenate di atas dan masukkan ke dalam 9 ml larutan BFP untuk mendapatkan pengenceran 10².  Siapkan pengenceran selanjutnya (10³) dengan mengambil 1 ml contoh dari pengenceran 10² ke dalam 9 ml larutan BFP.  Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali pada alat vortex.  Selanjutnya lakukan hal yang sama untuk pengenceran 10⁴, 10⁵…dst. sesuai kondisi contoh.

 Sampel Tuna

 Homogenat telah di stomacher

 Menuang BPA agar ke dalam petri

3.      Isolasi Staphylococcus aureus

a.       Secara aseptis pindahkan 1 ml dari setiap pengenceran 10¹, 10²,..dst. masukkan dalam 3 cawan petri masing-masing (0.4 ml, 0.3 ml, 0,3 ml) yang sudah berisi media BPA.

b.      Ratakan inokulum pada permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok dan biarkan inokulum sampai terserap ke dalam media kira-kira 10 menit dalam media BPA kering.  Bila inokulum belum terserap, letakkan cawan dalam incubator dengan posisi menghadap ke atas sekitar 1 jam.  Balik cawan petri dan inkubasi selama 45 jam – 48 jam pada suhu 35^oC ±1^oC.

c.       Koloni S. aureus pada BPA mempunyai cirri-ciri: koloni bundar, licin/halus, cembung, diameter 2 mm – 3 mm, warna abu-abu hingga kehitaman, sekeliling tepi koloni bening (terbentuk halo).  Koloni-koloni mempunyai konsistensi berlemak dan lengket bila diambil dengan jarum inokulasi.

d.      Strain yang berasal dari makanan beku atau makanan kering yang sudah lama disimpan, sering memberikan warna yang kurang hitam dibandingkan dengan koloni yang khas Staphylococcus aureus.  Selain itu kenampakan koloni juga kasar dan teksturnya kering.

1.      Perhitungan Koloni

a.       Pilih cawan yang mempunyai jumlah koloni 20-200.  Hitung dan catat jumlah koloni

b.      Bila terdapat beberapa jenis koloni yang terlihat seperti S. aureus pada cawan petri, hitung masing-masing jenis tersebut dan catat hasil perhitungannya secara terpisah.

c.       Jika cawan petri pada pengenceran terendah berisi kurang dari 20 koloni, data koloni dapat digunakan.

d.      Bila terdapat cawan yang berisi lebih dari 200 koloni dengan ciri-ciri S. aureus dan pada pengenceran yang lebih tinggi tidak ditemukan koloni, maka gunakan cawan tersebut untuk menghitung S. aureus.

e.      Ambil 2 atau lebih koloni terduga untuk uji koagulase dan uji tambahan.

2.      Uji Koagulase

a.       Inokulasi koloni terduga S. aureus ke dalam 2 ml HBI broth dan inkubasi 18 jam-24 jam pada suhu 35^oC ±1^oC.

b.      Pindahkan 0.2 ml-0.3 ml inokulum tersebut ke dalam tabung steril dan tambahkan 0.5 ml koagulase plasma kemudian aduk.  Inkubasi pada suhu 35^oC ±1^oC.  Amati tiap jam untuk 4 jam pertama dan selanjutnya hingga 24 jam untuk melihat terbentuknya koagulan. 

c.       Koagulan yang terbentuk secara padat/solid dan tidak jatuh apabila tabung dibalik dinyatakan positif (reaksi 4+) Staphylococcus aureus.  Koagulan yang menunjukkan reaksi 2+ dan 3 + harus dilakukan uji tambahan.  Tipe reaksi uji koagulase dapat dilihat pada Gambar.

Reaksi koagulase 4+

Atas (2+); tengah (3+); bawah (4+)

1.      Uji Tambahan

a.       Uji katalase

-          Ambil 1 ose inokulum dari BHI broth lalu goreskan ke dalam TSA miring dan inkubasi selama 18 jam-24 jam pada suhu 35^oC ±1^oC

-          Setelah diinkubasi, ambil 1 ose inokulum tersebut dan letakkan di atas gelas preparat.  Tetesi dengan H₂O₂ untuk melihat pembentukan gelembung-gelembung gas.

b.      Fermentasi Glukosa secara Anaerob

-          Ambil 1 ose inokulum dari BHI broth.  Inokulasikan ke tabung reaksi yang berisi media karbohidrat mengandung 0.5% glukosa, tutup lapisan atas dengan paraffin oil steril setebal 25 mm.

-          Inkubasi selama 5 hari pada suhu 35^oC ±1^oC.  Kondisi asam dihasilkan secara anerob jika terjadi perubahan warna media dari ungu menjadi kuning, ini menunjukkan adanya Staphylococcus aureus.

c.       Fermentasi Manitol secara Anaerob

Lakukan hal yang sama seperti fermentasi glukosa secara anaerob.  Gunakan manitol sebagai karbohidrat dalam media.  Staphylococcus aureus biasanya memberikan hasil positif yang ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna dari ungu ke kuning, tetapi beberapa strain memberikan hasil negatif.

Fermentasi glukosa & manitol 

sebelum inkubasi

Fermentasi glukosa & manitol

setelah inkubasi

d.      Uji Produksi Nuklease Thermostabil

Uji ini tidak dapat menggantikan uji koagulase tetapi hanya digunakan untuk mendukung pengujian yang memberikan reaksi koagulase 2+.  Pada uji ini, terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah muda cerah

-          Tuang 3 ml toludine blue-DNA agar di atas permukaan gelas preparat.  Setelah media agar tersebut membeku, lubangi dengan diameter 2 mm.

-          Ambil 0.01 ml kultur BHI broth yang telah dipanaskan dalam waterbath mendidih pada suhu 100^oC selama 15 menit.

-          Letakkan gelas preparat pada kondisi yang lembab dan inkubasi selama 4 jam pada suhu 35^oC ±1^oC.  Apabila terbentuk lingkaran berwarna merah muda cerah di sekeliling lubang sekurang-kurangnya 1 mm, menunjukkan reaksi positif.

 

Tabel 1.  Karakteristik yang khas dari Staphylococcus aureus, S. epidermis, dan Micrococci

Karakteristik	S. aureus	S. epidermis	Micrococci (a)
1.  Uji Katalase	+	+	+
2.  Uji Koagulase	+	-	-
3.  Uji Produksi Nuklease Thermostabil	+	+	-
4.  Fermentasi secara anaerob -  Glukosa - Manitol	+ +	+ -	- -
CATATAN:  a+, Mayoritas (90% atau lebih) strain adalah positif                       -, Mayoritas (90% atau lebih) strain adalah negatif

10.      Pelaporan Staphylococcus aureus dengan metode cawan hitung (Plate Count) agar sebar

Dari setiap pengenceran, jumlahkan koloni-koloni pada ketiga cawan Petri yang memberikan hasil koagulase atau uji tambahan positif kemudian kalikan dengan faktor pengencerannya.

Laporkan hasilnya sebagai jumlah Staphylococcus aureus per gram produk.

-          Untuk menghasilkan perhitungan yang akurat dan teliti, maka laporkan hasilnya dengan dua angka (digit) pertama sebagai hasil pembulatan.

-          Bulatkan ke atas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi, bila angka ketiga adalah 6, 7, 8 atau 9, maka gunakan angka 0 untuk masing-masing angka pada digit berikutnya.

-          Bulatkan ke bawah bila angka ketiga adalah 1, 2, 3 atau 4.  Bila angka ketiga 5, bulatkan ke atas bila angka kedua ganjil dan bulatkan ke bawah bila angka kedua itu genap

CONTOH:

Hasil Perhitungan                       Staphylococcus aureus

12.700                   menjadi           13.000

12.400                   menjadi           12.000

15.500                   menjadi           16.000

14.500                   menjadi           14.000